روش اسپکتروفتومتری جدید برای بتا-لاکتوگلوبولین طبیعی در شیر خام و فرآوری شده

چکیده

روش جدید شامل سه مرحله انتخابی برای جداسازی بتا-لاکتوگلوبولین طبیعی (β-lg) در شیر است: (۱) رسوب ایزوالکتریک کازئین‌ها؛ (۲) مرحله پیش ‌شرط ‌بندی با استفاده از یک بافر انتخابی برای بهبود حلالیت بتا-lg طبیعی مورد نیاز برای مقاومت در برابر دناتوراسیون و (۳) رسوب در حضور ۲٪ (وزنی) تری‌ کلرواستیک اسید (TCA). محلول‌های TCA فیلتر شده روی Econo Pak 10 DG نمک ‌زدایی شدند. محلول‌های حاوی بتا-lg طبیعی خالص به صورت اسپکتروفتومتری در طول موج ۲۸۰ نانومتر در مقابل یک نمونه شاهد تهیه شده با ۱۲٪ (وزنی) TCA اندازه ‌گیری شدند. جداسازی‌های کروماتوگرافی با استفاده از FPLC و یک ستون Superose 12 انجام شد. این روش جدید گزینش ‌پذیری بالایی برای بتا-lg طبیعی نشان می‌دهد، سریع است و نیازی به تجهیزات گران ‌قیمت ندارد. ضریب تغییرات کمتر از ۱.۹٪ محاسبه شد. برای پایش از دست رفتن β-lg طبیعی، پارامترهای سینتیکی و ترمودینامیکی برای دناتوراسیون ناشی از گرما در محدوده دمایی 70 تا 95 درجه سانتیگراد (90 تا 300 ثانیه) بررسی شدند و مرتبه واکنش 1.5 برای دناتوراسیون β-lg بدست آمد.

مقدمه

β-لاکتوگلوبولین (β-lg) یکی از اجزای اصلی بخش پروتئین آب پنیر در شیر گاو است که بیش از 50٪ از کل پروتئین آب پنیر را تشکیل می‌دهد. این پروتئین در دمای اتاق به صورت دیمری از دو مولکول مونومری غیر کووالانسی وجود دارد (McKenzie and Sawyer, 1967). دیمر β-lg با افزایش دما به صورت برگشت ‌پذیر به مونومرها تجزیه می‌شود. هر مونومر حاوی دو پل دی سولفیدی و یک گروه تیول منفرد است که در قسمت داخلی مولکول قرار دارد. β-lg گاوی یک پروتئین کروی معمولی با ساختارهای ثانویه و ثالثیه شناخته شده است (Papiz et al., 1986; Monaco et al., 1987). در طول عملیات حرارتی در شرایط فرآوری رایج، این ساختارها تحت تأثیر باز شدن جزئی مولکولی قرار می‌گیرند، همانطور که با قرار گرفتن در معرض گروه سولفیدریل پنهان نشان داده می‌شود (Harwalkar, 1980; De Wit, 1990). در نتیجه، β-lg می‌تواند از طریق تبادل سولفیدریل-دی‌سولفید و یا نیروهای آبگریز با سایر اجزای شیر تعامل داشته باشد (De Wit, 1981; Jang and Swaisgood, 1990; Wang and Swaisgood, 1993) که منجر به از دست رفتن β-lg طبیعی می‌شود. اهمیت دناتوراسیون β-lg در مقالات علمی در روابط متعدد بین درجه دناتوراسیون آن و ویژگی‌های ساختاری و پایداری محصولات لبنی مختلف، مانند ویسکوزیته کنسانتره شیر (Snoeren et al., 1982, Snoeren et al., 1983)، بافت ماست (Dannenberg and Kessler, 1988a, Dannenberg and Kessler, 1988b) یا پایداری گلبول‌های چربی پس از همگن‌سازی (Oortwijn and Walstra, 1979; Britten et al., 1994) مستند شده است. نمونه‌های بارز اثرات نامطلوب، تشکیل رسوبات روی دیواره‌های تجهیزات گرمایشی (دی جونگ، ۱۹۹۶) و اختلال در خواص رنتینگ شیر تحت عملیات حرارتی (لیسکه، ۱۹۹۷) است. برای افزایش اثرات مثبت و به حداقل رساندن اثرات مضر، دانش دقیقی از رفتار دناتوراسیون β-lg مورد نیاز است.

از متون علمی، مدل‌های کم شناخته شده‌ای وجود دارد که دناتوراسیون β-lg را به عنوان دو واکنش متوالی توصیف می‌کنند (داننبرگ و کسلر، ۱۹۸۸a؛ لوف، ۱۹۸۸؛ دی ویت، ۱۹۹۰؛ آنما و مک‌کنا، ۱۹۹۶). از روش‌های تحلیلی مختلفی برای بررسی میزان β-lg باز شده یا تجمع یافته استفاده شد. دی ویت (۱۹۹۰) نمونه‌های گرم شده را به مدت ۶۰ دقیقه در ۹۰۰۰۰ گرم سانتریفیوژ کرد و مایع رویی حاوی پروتئین غیر تجمع یافته را در pH 6.7 با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (SE-HPLC) تجزیه و تحلیل کرد. داننبرگ (1986) نمونه‌های گرم‌ شده را تا pH 4.6 اسیدی کرد تا پروتئین آب پنیر دناتوره شده را با استفاده از فوکوس ایزوالکتریک لایه بسیار نازک طبق روش رادولا (1980) رسوب دهد و رسوب را با دانسیتومتری تجزیه و تحلیل کند. روش رایج دیگر، روش لوف (1988) است که مایع رویی رسوب با pH 4.6 را با استفاده از HPLC فاز معکوس (RP-HPLC) تجزیه و تحلیل کرد. از همان سوبسترا برای تعیین محتوای پروتئین‌های آب پنیر طبیعی منفرد با استفاده از الکتروفورز ژل پلی‌اکریل‌آمید طبیعی (PAGE) استفاده شد. ژل‌های رنگ‌ آمیزی شده با استفاده از یک دانسیتومتر لیزری محاسباتی اسکن شدند (آنما و مک‌کنا، 1996). همه این روش‌ها طولانی هستند و به تجهیزات گران ‌قیمتی نیاز دارند. در عمل، تخمین دقیق β-lg طبیعی به عنوان یک کل ممکن است بیشتر از تمایز بین انواع ژنتیکی مورد توجه باشد. این کار با استفاده از روش اسپکتروفتومتری ارائه شده امکان ‌پذیر است. این سنجش بر اساس سه معیار انتخابی برای جداسازی کمی β-lg بومی از نمونه‌های شیر حرارت دیده و حرارت ندیده انجام می‌شود. در نتیجه، این مراحل تحلیلی با مقایسه آنها با نتایج کروماتوگرافی حذف اندازه و استفاده از یک سیستم کروماتوگرافی مایع پروتئین سریع (FPLC) با ستون Superose 12 بهینه شدند.

مواد لازم

• شیر خام تازه از یک مزرعه لبنی محلی دو بار در دمای 3000 گرم و دمای 15 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه چربی ‌گیری شد. شیر بازسازی ‌شده با معلق کردن 11 گرم پودر شیر بدون چربی با حرارت کم (NILAC، NIZO، Ede، هلند) در 100 گرم محلول آبی 1.8 میلی‌مولار CaCl2 تهیه شد. پس از هم زدن به مدت 30 دقیقه در دمای 30 درجه سانتیگراد، دما به 40 درجه سانتیگراد افزایش یافت و هم زدن به مدت 30 دقیقه دیگر ادامه یافت. شیر بازسازی ‌شده تا دمای 5 درجه سانتیگراد خنک شد و قبل از استفاده در یخچال نگهداری شد.
• بخش‌های پروتئین آب پنیر جدا شده β-lg (حاوی β-lg A و β

اثرات پیش تصفیه سوبسترا

ایده‌های اولیه برای جداسازی کل β-lg طبیعی از شیر بدون رسوب ایزوالکتریک اولیه کازئین و پروتئین تجمع یافته، همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است، نامناسب ثابت شد. ستون‌های A در مقایسه با رسوب ایزوالکتریک (ستون‌های B) یا رنتینگ (ستون‌های C) در شکل 1 نشان داده شده‌اند. تحت این شرایط، حدود 7.25٪ از β-lg در شیر با میسل‌های کازئین مرتبط بودند، با این فرض که β-lg در فیلتراسیون اسیدی و در آب پنیر رنت به 100٪ باز می‌گردد.

نتیجه ‌گیری

روش جدید برای تعیین β-lg طبیعی، انتخابی و به اندازه کافی حساس است تا بتواند تشخیص دهد که آیا تغییرات مولکولی برگشت ‌پذیر هستند یا خیر. با نظارت بر از دست دادن حالت طبیعی در دمای 70-85 درجه سانتیگراد تحت شرایط آزمایشگاهی خود، از معادله آرنیوس برای β-lg AB، انرژی فعال‌سازی (Ea) 271.37 کیلوژول بر مول و برای لگاریتم ضریب پیش نمایی نمودار آرنیوس (ln k0) مقدار 87.01 s-1 را محاسبه کردیم. هر دو تخمین با تخمین‌های دیگران مطابقت بسیار خوبی دارند.